１．研究テーマ

　　タンパク質を自由自在に合成する技術を開発することは、生命科学やバイオテクノロジー分野のみならず、ナノマシーンの設計など工学分野における分子素子の開発に大きく貢献すると期待できます。現在、タンパク質の合成にはＤＮＡを生細胞に導入する遺伝子工学的手法が広く利用されていますが、この方法で生産可能な外来性タンパク質は宿主の生命維持機構をくぐり抜けられる分子種に限られてしまいます。一方、有機合成技術が進展し、数十個のアミノ酸から成るペプチドを自動合成もできるようになっていますが、分子量のより大きなタンパク質を化学的に合成することは収率や副反応などの限界から、現在においてもきわめて困難です。

図１．タンパク質生産法の比較

このような問題点を打破する新しいタンパク質合成法として、化学的手法を取り入れ、生物体の優れた特性を最大限に利用しようとする、無細胞合成法をあげることができます。この方法は、生体の遺伝情報翻訳系を人工容器内に取り揃え、設計・合成した核酸を鋳型として、アミノ酸を必要な残基数、望みの順番に結合させることのできる系を再構築しようというものです（図２）。このシステムでは、生命体の制約を受けることがないので、合成可能なタンパク質分子種を殆ど無限大にまで広げることが期待できます。

図２．無細胞タンパク質合成法

２．コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法
　すり潰した細胞液にタンパク質合成能が残存することが５０年前に報告されて以来、種々の無細胞タンパク質合成系が開発されてきました。そして、教科書にでているように、遺伝暗号の解読やタンパク質生合成メカニズムの解析に成果をあげました。現在では、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽由来の無細胞系などはとくにタンパク質合成活性が高いことから市販もされており、放射性同位元素標識と免疫学的手段を組み合わせて遺伝子産物の同定等に広く利用されています。無細胞系における翻訳速度は生細胞中とほぼ同等で、大腸菌などの原核生物では４５ペプチド結合生成／秒（一方、真核生物では４ペプチド結合生成／秒）であり、高速性と翻訳の正確性に優れた特性を保持しています。しかしながら、なぜか、いずれの無細胞系も不安定で合成反応の持続時間が短く、得られる産物の量は生細胞のせいぜい0.1％であってタンパク質の調製法としては実用的ではありませんでした。この無細胞タンパク質合成法の不安定性の原因については研究対象となりませんでしたが、これは、たぶん、細胞を物理的に破砕し、人工の緩衝液で調製すると細胞抽出液中の酵素活性が低下するということが生化学分野では常識となっていたからでしょう。私達はこれまでに生物化学兵器としても知られる猛毒のヒマ種子毒素、ライシン(Ricin) や大腸菌Ｏ-１５７毒素(Vero toxin) の細胞毒素作用がタンパク質合成装置の本体であるリボソームの酵素的な不活性化に起因することを分子レベルで解明してきました。そしてこれらの研究から、植物には殆ど普遍的にその存在が知られていた抗ウイルスタンパク質の分子機構が、それらの毒素と同一であることや、コムギ種子にもトリチンと名付けられたリボソーム不活性化タンパク質が存在することも明らかにすることができました。このような知見をもとに検討したところ、無細胞系に一般的に観察されるタンパク質合成反応の不安定化現象は、本来すべての生物体にプログラムされたウイルスなど対病原微生物防御機構としての自己リボソーム不活性化機構（細胞自殺機構）のスイッチが、胚芽破砕が引き金となって起動することに起因することを示す結果を得ることができました。すなわち、トリチン活性などの生体が備えている自殺因子群を排除することによって、合成活性を大幅に上昇させることが期待されました。そして実際、自殺因子を排除した胚芽から調製した抽出液をタンパク質合成反応の酵素源として用いると、タンパク質合成反応が従来の系と比べて著しく安定化し、合成量を従来の１０００倍以上に上昇させることができました。

　これらの発見と開発技術を基盤として、実用的なコムギ胚芽無細胞タンパク質合成法を確立するため、以下の４つの要素技術を開発しました。すなわち、（１）高翻訳促進能を有するｍＲＮＡ非翻訳配列、（２）コムギ胚芽無細胞系専用高発現ベクター（愛媛大学プラスミドpEU）の構築、（３）タンパク質合成の新しい反応法、（４）ＰＣＲ法との組合せによる多品目機能解析用のタンパク質合成法などです。図３には、これらの要素技術を統合した実用的なハイスループット（HT）タンパク質合成法のフローチャートです。この方法では、ＰＣＲをフルに利用することによって、大腸菌からプラスミドを精製することなく、もしくは、化学合成した遺伝子から転写鋳型を構築する。これを用いて鋳型合成したmRNAを高効率コムギ胚芽抽出液を含む翻訳液と混合・保温することによって、反応液１ｍｌ当たり、数十μｇから数ｍｇのタンパク質を簡便に合成することが可能となりました。

図３．コムギ胚芽無細胞タンパク質合成の手順

　最近、この手順のうちの転写鋳型構築の後のすべての操作を自動化することに成功しました。GeneDecoderと名付けたこのロボット（図４A）は４本の分注用アーム、遠心機、mRNA精製装置や恒温槽を備え、スプリットーＰＣＲ法によって構築したDNAから、一晩のうちに３８４種類のタンパク質を合成する性能をもっています。GeneDecoderと後述のタンパク質大量合成ロボットProtemistは米国ウイスコンシン大学などで活躍しております。図４Bには、超ＨＴ性能を持ったSuper GeneDecoderを示しています。本ロボットでは、６０時間の間に、６０００個の遺伝子からタンパク質を合成することが可能で、今日のゲノム解析速度にマッチさせたものです。両ロボットが合成するタンパク質の量は、タンパク質リン酸化酵素の例でいうと、約１０００回分のアッセイに利用できる充分なものです。図４Cはタンパク質大量（小品種）合成用ロボットProtemistです。本ロボットは一晩のうちに数ｍｇ〜１０ｍｇ程度のタンパク質を合成することができます。

　図４．開発した三つのタイプの全自動タンパク質合成ロボット

　コムギ高効率無細胞タンパク質合成法を用いるポストゲノム時代の研究戦略と産業への応用手順をまとめると、次のようになります。すなわち、１）コンピューターによる目的遺伝子の選択→　２）遺伝子DNAの化学合成、３）ＰＣＲ法による転写鋳型の構築とmRNA合成→　３）遺伝子情報機能等スクリーニングのためのコムギ胚芽無細胞システムによるタンパク質の少量合成→　４）pEUへのクローニングと同無細胞システムによるタンパク質の大量生産→　５）タンパク質の構造解析→　医薬品の開発、ワクチン製造など、となります。

３．無細胞タンパク質合成法の展望
　無細胞タンパク質合成法が確立したことによって、生命体の中心教義である遺伝情報の伝達（DNA←→RNA→タンパク質）のすべての過程を試験管の中で再現することが可能になります。以下、本無細胞タンパク質合成法の基礎学問や産業に対する従来のバイオテクノロジーの範疇を越える応用の可能性について展望してみます。地球上にはさまざまな生き物がいますが、一群の極限環境生物と呼ばれる微生物は、１万メートルを越える深海（２℃、１０００気圧）や地下８０００メートル（３００℃、３０００気圧）を住みかとしています。地表の生物圏を上回るとも言われている極限環境微生物の仲間には、１００年に１回しか細胞分裂しない種類もあるらしいのです。もしも地球外生命体、例えば火星や土星の衛星であるタイタンの土中深くに生命体が生きている（・・・いた）としたら、そのようなタイプの微生物ではないかと想像されています。人類が長年付き合ってきた地表の微生物でさえも、培養法が確立しているのは１％にも満たず、残りの大半の生物についてはその存在を確認することも容易ではありません。このような生物は培養ができないが故に従来の生物学の対象にはなり得ませんでした。無細胞タンパク質合成法の最大の特徴は、遺伝子情報さえあればタンパク質を試験管内で自由自在に合成することができる点です。この特性をフルに活用し、原理的にあるいは危険性や倫理的に飼育・培養できない生物を対象として、生命体を直接扱うことなしに生き物を研究する新分野（非細胞生物学？）が創成できるのではないでしょうか？　その方法論としては、（１）微量の試料からPCR法で増幅させたDNAを鋳型として、無細胞タンパク質合成法を用いて遺伝子産物を調製する、（２）それらの生化学的性状を網羅的に解析する、（３）得られる知見を生命情報分野のパワーで解析・統合し、生命体をコンピュータ画面上に再構築（４次元）する、という手順なのですが・・・。また、極限環境に棲む微生物の持つ酵素はその機能性・安定性特性を備えおり、化学産業における触媒としての有用性などが期待できるでしょう。
　更なる夢を続けてみると：本システムは生命体のプロセスをバイパスしていることから、翻訳酵素系の触媒機能を妨害しない限りにおいてどのようなアミノ酸配列から成るタンパク質でも合成することができるでしょう。すなわち、生命体が進化の過程で選択しなかったタンパク質分子をも合成することが可能であると期待できます。仮に４００個のアミノ酸残基からなるタンパク質のサイズ（ヒトのタンパク質の平均残基数は４００と見積もられている）を考えてみると、そのような配列空間は、天然アミノ酸２０種で、２０^４００と計算され、４０億年の進化の過程で生命体が選択してきたタンパク質はその数に比べると０に近いわずか一兆種類ともいわれています。本タンパク質合成法が、これまで合成方法が無かったがゆえに残りの無尽蔵で手つかずのタンパク質分子（金鉱？、毒物の詰まったパンドラの箱？）から有用分子を掘り起こすための鍬として利用できるかも知れません。


４．施設設備
　遺伝子構造解析や無細胞タンパク質合成システムで得られるタンパク質の構造・機能解析に必要な機器を中心に以下のように整備されています。

１階：ＮＭＲ実験室、放射性同位元素実験室

２階：機能構造解析室、高分子合成室

３階：生化学実験室、試料調製室、低温室、培養室

４階：情報処理室、会議室

５．ベンチャーの育成

　企業化されている本技術とその商品：

　インビトロテック社（www.invitrotech.co.jp/）、TOYOBO(www.toyobo.co.jp/) ：研究用コムギ胚芽無細胞タンパク質合成キット

　セルフリーサイエンス社(www.cfsciences.com/)　：全自動無細胞タンパク質合成ロボット他

　ゾイジーン社(www.zoegene.co.jp/)　：タンパク質機能・構造解析


６．主な共同研究先（海外）

　カリフォルニア大学（UC Berkley, UCSF, UC Santa Cruz)

　ウィスコンシン大学(Madison, Milwaukee)

　ラトガス大学

　ケンブリッジ大学

　バイロイト大学
　
　米国国立衛生研究所(NIH)

　米国エネルギー省（Pacific Northwest National Laboratory, Sandia National Laboratory)

連絡先
　〒７９０−８５７７　
　松山市文京町３番　愛媛大学ベンチャー・ビジネス・ラボラトリー

　TEL：０８９−９２７−８９６０

　FAX：０８９−９２７−８５２８